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金莎唯一官方娛乐场:北理工课题组在CRISPR系统元件筛选方面取得重要进展


近日,北京理工大学霍毅欣教授团队在CRISPR/Cas9系统功能性sgRNA突变体筛选方面取得重要进展。相关研究成果以“Identification of functional sgRNA mutants lacking canonical secondary structure using high-throughput FACS screening”为题发表在Cell 子刊《Cell Reports》上(https://doi.org/10.1016/j.celrep.金莎唯一官方娛乐场.114290)。该工作以北京理工大学为第一通讯单位,博士生梁泽宇为第一作者,霍毅欣教授为通讯作者。

CRISPR/Cas9介导的基因编辑已经成为一种强大的基因改造技术,该系统的主要元件为Cas9蛋白与sgRNA。在sgRNA的引导下,Cas9-sgRNA二元复合体可以识别特定的DNA靶点,并在该位点使DNA序列产生双链断裂。在对底盘菌株进行代谢工程改造时,往往需要对多个目标靶点进行基因操作,而在CRISPR系统中共表达多个相同的sgRNA易触发遗传不稳定性导致序列丢失。现有的sgRNA筛选系统通常是基于CRISPRi系统设计的,因此无法保证所筛选得到的sgRNA突变体与Cas9蛋白形成复合体后仍具有核酸酶活性 (图1)。相同sgRNA突变体与Cas9结合后抑制活性与核酸酶活性不一致这一现象有研究提及,但尚未得到系统分析和详细报道。为了评价现有的sgRNA突变体是否可以用于基因改造,我们系统性地设计了鉴定sgRNA突变体与Cas9蛋白结合后DNA结合活性与核酸酶活性的系统,发现相同的sgRNA序列两种活性存在不一致的情况。因此我们需要得到与现有的野生型sgRNA序列差异较大的sgRNA突变体。

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图1 现有sgRNA突变体活性分析

本团队长期从事CRISPR系统机制探究以及高效基因编辑方法学开发,2019年以“CRISPR-Cas9-assisted native end-joining editing offers a simple strategy for efficient genetic engineering in Escherichia coli”为题,在领域顶级期刊《Applied Microbiology and Biotechnology》上发表。该工作报道了一种基于原核体内的微同源末端重组系统的CRISPR/Cas9基因编辑方法,是一种最简单的基因编辑方法。我们利用该研究的DNA修复方法设计了一种基于生长和/或荧光激活细胞分。‵ACS)的高通量sgRNA突变体正向筛选系统。我们首先在筛选标签中插入一段可以被识别的DNA靶点序列,并引入一段同源序列。当sgRNA突变体与Cas9蛋白形成二元复合体,并在有活性的sgRNA突变体引导下结合至DNA靶点序列形成三元复合体,激活Cas9蛋白核酸酶活性后,在所设计的DNA靶点将会出现双链断裂,激活原核细胞内的同源修复系统。该同源修复系统利用我们所引入的同源序列进行筛选标签的修复,使得细胞在筛选条件下出现可被筛选的表型,如可在抗性平板上生长或是通过流式细胞仪进行分选 (图2)。